食品檢測中的菌落總數

 一、菌落總數的概念及衛生意義 

1、菌落總數
     食品檢樣經過處理，在一定條件下培養后（如培養基成分、培養溫度和時間、pH、需氧性質等），所得1mL （或1g）檢樣中形成菌落的總數。
    按國家標準方法規定，即在需氧情況下，37℃培養48h，能在 平板計數 瓊脂平板上生長的細菌菌落總數，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養要求的以及非嗜中溫的細菌，由于現有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此菌落總數并不表示實際中的所有細菌總數，菌落總數并不能區分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數，需氧菌數等。
2、細菌總數
   指一定數量或面積的食品樣品．經過適當的處理后，在顯微鏡下對細菌進行直接計數。其中包括各種活菌數和尚未消失的死菌數。細菌總數也稱細菌直接顯微鏡數。通常以1g或1mL或1cm2樣品中的細菌總數來表示。

3 菌落總數在食品衛生質量評價中的意義

1）食品中細菌數量可反映該食品被污染的程度 
 新鮮的食品內部一般是沒有或很少有細菌的，但由于外界污染情況不同，食品被細菌污染的多少就有所不同。食品中細菌數量越多，說明被污染的程度就越嚴重，越不新鮮，對人體健康威脅越大。相反，食品中菌數越少，說明該食品被污染的程度越輕，食品衛生質量越好，對人體健康影響也越小。 
2）食品中細菌數量可預測食品耐放程度和時間 
一般講，細菌數越少，食品耐放時間越長；相反，食品耐放時間就越短，例如用O℃保存牛肉，菌落總數為103cfu／cm2時，可保存18天，而當菌落總數增至lO5cfu／cm2時則只能保存7天。另外，用0℃保存魚時，菌落總數為105cfu／cm2時可保存6天．而菌落總數在103cfu／cm2時則可保存12天。 
3）食品中細菌數量可估測出食品變質狀況 
一般認為日常食品的活菌數為104～107cfu／g。而當活菌數達到108cfu／g則可認為處于初期變質階段。例如，活的家禽，皮膚表面的細菌數可低到1.5×103cfu／cm2。而加工后馬上檢測可達3.5×104cfu／cm2。當菌落數為107cfu/cm2時表示確已經變質，雞肉的細菌數達108cfu／cm2時可有氣味并變粘。
一般講，食品中細菌數量越多，則會加速變質過程的進程，甚至可能引起食用者的不良反應。
二、菌落總數的常規檢驗方法菌落總數的常規檢驗方法(GB4789．2-2008)：
基本操作一般包括：樣品的稀釋——傾注平皿——培養48（24）小時——計數報告。

（一）樣品的處理和稀釋：1．操作方法：
1）、以無菌操作取檢樣25g（或25ml)，放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。
固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。
2）、用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。
3）、另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。
2．無菌操作：
操作中必須有“無菌操作"的概念，所用玻璃器皿必須是*滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝，應用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。
　操作應當在超凈工作臺或經過消毒處理的無菌室進行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個平板不得超過15個菌落。3．采樣的代表性：如系固體樣品，取樣時不應集中一點，宜多采幾個部位。固體樣品必須經過均質或研磨，液體樣品須經過振搖，以獲得均勻稀釋液。
4．稀釋液：樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1％蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。

（二）傾注培養

1．操作方法： 
1）、根據標準要求或對污染情況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。
2）將涼至46℃平板計數瓊脂培養基注入平皿約15mL，并轉動平皿，混合均勻。同時將平板計數瓊脂培養基傾入加有1mL稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內作空白對照。
3）待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養48±2h，取出計算平板內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數。 
2．傾注用培養基應在46℃水浴內保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。
傾注培養基的量規定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數觀察。
　3．為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養基并旋轉混勻，可正反兩個方向旋轉，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。

4．培養溫度一般為37℃（水產品的培養溫度，由于其生活環境水溫較低，故多采用30℃）。培養時間一般為48h，有些方法只要求24h的培養即可計數。培養箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養48h后，培養基失重不應超過15％。
5．為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質與細菌菌落發生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培養基混合的平板，不經培養，而于4℃環境中放置，以便計數時作對照觀察。
　在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養后菌落呈紅色，易于分別。

 （三）計數和報告

1．操作方法：培養到時間后，計數每個平板上的菌落數。可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數，計算出原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數，進行報告。

2．到達規定培養時間，應立即計數。如果不能立即計數，應將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。

3.稀釋度選擇及菌落數報告方式
1）. 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每克（或毫升）中菌落總數結果。
2）. 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按式（l）計算：
N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（1）
式中：
N―樣品中菌落數；
∑C―平板（含適宜范圍菌落數的平板）菌落數之和；
n 1―個適宜稀釋度接種平板個數
n2―第二個適宜稀釋度接種平板個數；
d―稀釋因子（稀釋度）。
3）. 若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。
4）. 若所有稀釋度的平板菌落數均小于30，則應按稀釋度較低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
5）. 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以較低稀釋倍數計算。
6）. 若所有稀釋度的平板菌落數均不在30~300之間，其中一部分小于30或大于300時，則以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

菌落總數的報告
1）. 菌落數在100以內時，按“四舍五人"原則修約，采用兩位有效數字報告。
2）. 大于或等于100時，第三位數字采用“四舍五人"原則修約后，取前兩位數字，后面用0代替位數；也可用10的指數形式來表示，按“四舍五入"原則修約后，采用兩位有效數字。
3）. 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延。
4）. 若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。
5）. 稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL 為單位報告。

（四）特別注意

1 不同稀釋度的菌落數應與稀釋倍數成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數應基本接近），即稀釋倍數愈高菌落數愈少，稀釋倍數愈低菌落數愈多。如出現逆反現象，則應視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現逆反現象，如酸性飲料等），不應作為檢樣計數報告的依據。
2．當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數乘2代表全平板的菌落數。
3．當計數平板內的菌落數過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數。再乘以相應稀釋倍數作為該平板的菌落數。